Metodo: coagulativo Campione: plasma citrato
Tempo di refertazione: 2 gg Valori di riferimento:ratio

2,00-3,60

eterozigoti 1,50-2,00

omozigoti  1,30-1,50

 

 

La TVP e l’EP sono un problema sanitario di notevole importanza arrivando ad un’incidenza di circa l’1 x 1.000/anno.

Diversi fattori di rischio genetici in grado di determinare una tendenza alla trombosi di tipo familiare, si sono dimostrati importanti. Fino a poco tempo fa difetti genetici (dell’AT III, della PC e della PS) venivano trovati in circa il 20% dei casi di trombosi familiare, ma in meno dell’8% delle trombosi recidivanti.

Nella maggior parte dei pazienti mancava una spiegazione di laboratorio che giustificasse la tendenza genetica alla TVP.

La capacità di diagnosi è aumentata enormemente da quando Dahlback hanno scoperto l’APC-R.

Successive indagini condotte nelle nazioni occidentali hanno mostrato che l’APC-R era il responsabile di:

  • circa il 20% dei casi di trombosi venose consecutive
  • di circa il 50% dei casi selezionati di trombosi familiare.

Quindi l’APC-R è il maggior fattore di rischio per trombosi venosa.

La l’APC-R in molti casi è determinata da una mutazione puntiforme (chiamata Fattore V Leiden o fattore V R506Q) nel gene del F.V che rende il F.Va resistente all’azione della Proteina C attivata. Circa il 5% della popolazione europea è portatore della mutazione.

 

BASE MOLECOLARE per l’APC-RESISTENZA 

Cosa accade se un sito di clivaggio dell’APC è cambiato

Come detto prima, la sola base molecolare conosciuta per il fenotipo dell’APC resistenza è una mutazione puntiforme del gene del F.V che sostituisce la glicina del codone CGA con una alanina codone CAA in corrispondenza del nucleotide 1.691 nell’esone 1013. La mutazione rimpiazza l’arginina R con una glutammina Q in posizione 506 nella molecola del Fattore V modificando in questo modo uno dei siti di clivaggio dell’APC.

Il F.V mutante R506Q esprime una molecola con normale attività procoagulante quando attivata dalla trombina o dal fattore Xa, ma la sua velocità di inattivazione è di circa 10 volte più bassa di quella di un normale F.Va.

Questa resistenza all’APC stabilizza il complesso protrombinasi e porta alla generazione di elevate quantità di trombina e ad uno stato di ipercoagulabità.

Poiché il F.V mutante può essere ancora inattivato dal clivaggio dell’APC in corrispondenza dell’Arginina 306 e dell’Arginina 679, è probabile che l’iniziale sito di clivaggio dell’APC in corrispondenza dell’Arginina 506 promuova l’inattivazione del F.Va ma non sia indispensabile.

Questo potrebbe giustificare l’osservazione di stati di ipercoagulabilità relativamente leggeri osservati in individui APC-resistenti e spiega perché è necessario un secondo fattore di rischio, genetico o acquisito, perché si possa sviluppare la trombosi.

 

CASI di APC-RESISTENZA SENZA SPIEGAZIONE

C’è una moltitudine di difetti genetici che potrebbero causare resistenza all’APC senza una mutazione in corrispondenza dell’Arginina 562 nel F.VIII o una mutazione dell’Arginina 306 nel F.V.

Sebbene nessuno di questi sia stato riportato è chiaro che almeno un 4-6% dei casi di APC resistenza nelle nazioni occidentali non coinvolgano la mutazione del F.V R506Q, indicando che sono coinvolti ulteriori difetti genetici o acquisiti sconosciuti.

Al momento attuale, la sola via praticabile per identificare soggetti predisposti a trombosi APC resistenti senza la mutazione del F.V R506 Q è quella di eseguire un test di screening coagulativo ed osservare il fenomeno della resistenza all’APC.

 

ASPETTI CLINICI DELLA RESISTENZA ALL’APC

 

TROMBOFILIA EREDITARIA

Trombofilia è un termine generico collegato essenzialmente a vari tipi di disordini ereditari del meccanismo emostatico che possono essere causa di una aumentata tendenza familiare alla trombosi. L’ereditarietà o la tendenza familiare alla trombofilia si manifesta in generale ad un’età relativamente giovanile (al di sotto dei 45 anni), ed è associata ad episodi trombotici ricorrenti. Le manifestazioni cliniche più frequenti sono la trombosi venosa degli arti inferiori con o senza embolia polmonare.

Circa il 50% dei pazienti trombofilici hanno il loro primo evento trombotico in combinazione con altri fattori di rischio circostanziali quali gravidanza, chirurgia, contraccettivi orali e circa la metà di tutti i pazienti hanno una storia familiare positiva.

 

L’APC è UN FATTORE DI RISCHIO COMUNE DI TROMBOSI VENOSA

Fin dalla sua scoperta la APCr è stata riconosciuta come la maggiore causa di trombofilia ereditaria. La maggior parte dei casi può essere spiegata con la mutazione del F.V R506Q.

Il rischio relativo di trombosi venosa per i portatori di questa mutazione è stato stimato in circa 7 volte per gli eterozigoti (difetto singolo) e circa 80 volte per gli omozigoti (difetto doppio). Un’analisi generale dei pazienti con eventi trombotici, studiati sia consecutivamente o dopo selezione, ha mostrato una prevalenza della resistenza all’APC di circa il 20%.

Le frequenze riportate mostrano un range di variazione molto ampio (0-64%), dovuto essenzialmente alle differenze nei criteri di selezione dei pazienti, come l’esclusione dei pazienti al di sopra di una certa età, coloro che erano in TAO e/o coloro che avevano cause di trombofilia già conosciute. Comunque, questo può in parte riflettere anche una diversa distribuzione del F.V R506Q, come allele nella popolazione generale.

Prevalenze notevoli della resistenza all’APC e del F.V R506Q sono state riportate in individui sani in diversi paesi europei e più specificamente, la Grecia (14%), la Francia (10%), Regno Unito (9%), Germania (8%), Svezia (7%), Olanda (5%). L’alta prevalenza dell’APCr in questi paesi indica che la mutazione è avvenuta in tempi antichi nella popolazione che ha fondato l’Europa e che potrebbe essere legata ad un vantaggio evolutivo (probabilmente la protezione contro situazioni causanti una perdita eccessiva del sangue che poi è stata mantenuta nelle popolazioni). Finora, la mutazione del F.V R506 Q non è stata dimostrata nella popolazione giapponese, cinese, africana o araba. Ciò potrebbe spiegare l’incidenza relativamente bassa del tromboembolismo venoso riportato in queste razze.

L’analisi cumulativa del F.Va R506Q tra gli individui sani europei ha mostrato una prevalenza del 5.5% (di cui il 5.3% sono eterozigoti e lo 0,1% sono omozigoti).

 

LA DIAGNOSI DI LABORATORIO dell’APC RESISTENZA

Il fenotipo APCr è stato originariamente caratterizzato mediante un dosaggio basato sull’APTT in cui si aveva una risposta anticoagulante ridotta ad una quantità fissa di APC aggiunta. Con una diagnosi basata su un APC ratio < 2.23, il test dell’APCr standard in un gruppo di pazienti con trombosi venosa ha mostrato:

  • una sensibilità del 76%
  • una specificità del 98%

Insomma, usando solo il test standard il 24% degli eterozigoti potrebbero non essere identificati ed il 2% dei normali potrebbero essere diagnosticati come soggetti con la mutazione del F.V. Elevando questa soglia di cut-off si piò ovviamente aumentare la sensibilità al 100%, ma con una concomitante diminuzione della specificità.

Il problema è che usando il test standard per l’APCr sarebbe necessaria un’analisi della mutazione per F.V R506Q in circa il 30-50% dei soggetti indagati per poter confermare la diagnosi. Questo, ovviamente, ha sollevato la questione se debba essere usato o meno un dosaggio basato sul DNA invece del dosaggio funzionale di screening per l’APCr.

Tuttavia, il vantaggio clinico ottenuto dall’APC ratio del test standard è una indicazione anche sulla gravità dell’APCr e quindi rileva i casi con maggiore tendenza alla trombosi anche senza la mutazione del F.V R506Q. Il test standard dovrebbe quindi essere eseguito e considerato primariamente come un test di screening, il cui primo scopo è di ricercare individui con il fenotipo dell’APCr. Usando un test per l’APCr modificato in cui il plasma del paziente viene diluito in plasma carente di F.V, la sensibilità e la specificità per la mutazione del F.V R506Q viene aumentata a quasi il 100%. Altre cause di APCr collegate a deficit non noti del F.V potrebbero non essere rilevate da questo metodo che, tra l’altro, permette di testare campioni di pazienti in trattamento con eparina o anticoagulanti orali.

Un approccio pratico allo screening potrebbe essere quello di analizzare nella stessa serie ciascun campione di plasma usando sia il metodo standard sia quello modificato.

Quei soggetti che presentassero risultati patologici nel test modificato sarebbero candidati quindi ad una genotipizzazione per il F.V. Questa strategia identificherebbe i pazienti APC-R sia con che senza la mutazione F.V R506Q e ridurrebbe la necessità di conferma col test genetico su un numero minimo.

 

L’APC RATIO INDICA LA SEVERITA’ DELLA RESISTENZA ALL’APC

Zoller e Coll. hanno studiato 50 famiglie svedesi con APCr. Essi hanno potuto osservare:

  • che in 3 delle famiglie non era presente la mutazione del F.V R506Q, la qual cosa suggerisce la presenza di un’altra causa non identificata di APCr;
  • che l’APC ratio era basso in tutti gli omozigoti e nella maggior parte degli eterozigoti;
  • che l’APC ratio negli individui senza la mutazione si distribuiva nel range da 1.3 a 2.0;
  • che gli eterozigoti con una storia di trombosi avevano anche una APC ratio più basso di quelli che non avevano avuto trombosi;
  • che nessuno degli eterozigoti con un APC ratio superiore a 2 aveva avuto eventi trombotici;
  • che i parenti senza la mutazione, ma con una storia di trombosi avevano un APC ratio significativamente più basso di quello dei pazienti senza trombosi.

Tra i 2 gruppi venivano osservate inoltre differenze significative sia nell’APC ratio che nella curva di sopravvivenza senza trombosi, confermando quindi che l’APCr è un fattore di rischio importante di trombosi.

Ad un’età di 33 anni manifestazioni trombotiche venose erano state osservate:

  • nell’8% dei normali
  • nel 20% degli eterozigoti
  • nel 40% degli omozigoti

L’età media per il primo evento trombotico era 25 (con un range da 10 a 40 anni) per gli omozigoti e 36 (con un range da 18 a 71 anni) per gli eterozigoti.

In alcune famiglie l’incidenza di trombosi era più alta di quanto atteso e questo suggeriva che queste famiglie erano affette da un difetto genetico aggiuntivo.

 

 

 

TROMBOSI VENOSA come RISULTATO di FATTORI di RISCHIO GENETICI MULTIPLI

A lungo nel sistema della coagulazione è stato considerato che il difetto genetico singolo fossa la causa scatenante di trombofilia familiare.

L’evidenza che questa idea fosse troppo semplice è stata ripetutamente evidenziata negli anni passati, particolarmente a proposito delle famiglie con carenza di proteina C.

La carenza di Proteina C ereditaria è sicuramente associata ad un aumentato rischio di trombosi. Ciò nonostante per ragioni misteriose la stessa mutazione della proteina C può condizionare in maniera diversa le diverse famiglie.

Inoltre, dei soggetti con carenza di proteina C solo 1 su 70 mostrerà sintomi (con una prevalenza di totale di circa lo 0.2%).

Il ruolo dei fattori circostanziali che scatenano l’evento trombotico può spiegare questa disparità, ma rimane ancora da chiarire perché circa il 60% di essi ha il suo primo evento trombotico spontaneamente.

Una migliore spiegazione del perché solo alcuni degli individui con la carenza di Proteina C sono sintomatici è la co-ereditarietà di uno o più difetti genici.

Considerando l’alta prevalenza dell’APCr sembrerebbe questo essere il primo candidato. Ciò viene supportato da studi recenti che mostrano un’alta incidenza della mutazione del F.V R506Q tra i soggetti con carenza di Proteina C sintomatici (circa il 14-19%), così come nelle famiglie e probandi con carenza di Proteina S (38%).

 

L’APC r e il TROMBOEMBOLISMO ARTERIOSO

Lindblad ed altri hanno riportato per primi un caso di un uomo di 32 anni con un tromboembolismo arterioso fatale ed una APCr severa (ratio < 1.6).

In uno studio di Halbmayer ed altri, la associazione fra resistenza all’APC e trombosi arteriosa è stata studiata in un gruppo di pazienti con stroke giovanile ed è stata riscontrata essere simile a quella osservata nei pazienti con trombosi venosa (20%).

Una possibile associazione fra APCr e stroke è stata suggerita anche da Simioni et al. Che avevano effettuato uno studio caso-controllo in pazienti giovani con stroke ischemico e APCr.

Tuttavia. La maggior parte delle pubblicazioni mostra un’incidenza della mutazione del F.V R506 Q in pazienti con stroke simile a quella trovata in soggetti normali di controllo, il che indicherebbe che non c’è alcuna associazione fra APCr e trombosi arteriosa causante lo stroke. E’ stata anche studiata la possibile correlazione fra la mutazione del F.V e la cardiopatia ischemica in particolare con l’infarto del miocardio.

Con l’eccezione di 1 pubblicazione, tutte le altre concludono che la mutazione non è un fattore di rischio per trombosi arteriosa negli individui con eterozigosi, sebbene non escludano la possibilità negli individui omozigoti.

Un’osservazione molto interessante è stata fatta da Kontula ed altri in pazienti con ischemia cerebrale in cui hanno mostrato uno stato di portatore della mutazione associato con emicrania classica.

 

AUMENTATO RISCHIO di TROMBOSI VENOSA in SOGGETTI APC RESISTENTI che usano CONTRACCETTIVI ORALI

I contraccettivi orali estroprogestinici sono un fattore di rischio molto dibattuto per la trombosi venosa. In donne che usano contraccettivi orali sono stati riportati aumentati livelli di fibrinogeno e di fattori procoagulanti e ridotti livelli di AT III e PS con ridotta resistenza all’APC. Si è assunto che questi cambiamenti fossero indotti dagli ormoni e disturbassero l’equilibrio emostatico risultando in uno stato protrombotico.

Per la maggioranza delle donne che assumono contraccettivi questo disequilibrio è di importanza minore, ma per un piccolo numero di donne con un rischio genetico o acquisito che le predispone alla trombosi, l’aggiunta dell’influsso protrombotico dei contraccettivi orali, può essere sufficiente a scatenare un evento trombotico.

Vandenbrouche e Coll., in Olanda, hanno studiato il rischio di trombosi venosa in donne in trattamento con contraccettivi orali. Un gruppo di 155 donne in premenopausa che avevano sviluppato trombosi venosa in assenza di ogni altro difetto predisponente è stato confrontato con 169 controlli sani:

  • il rischio di trombosi fra le utilizzatrici di contraccettivi orali è stato determinato come 4 volte maggiore quando confrontato a donne che non assumevano contraccettivi orali  (il rischio di base era di circa 0.01%/anno);
  • le donne eterozigoti per la mutazione che non usavano i contraccettivi orali avevano un aumento del rischio trombotico di 8 volte;
  • il rischio era di 35 volte quando le donne eterozigoti assumevano i contraccettivi orali.

L’effetto congiunto dei 2 fattori di rischio sembrava quindi essere all’incirca moltiplicativo.

  • con un simile effetto moltiplicativo, il rischio aumenta di circa 100 volte per le donne omozigoti che assumono contraccettivi orali.

Un numero sufficientemente grande potrebbe essere quindi messo a notevole rischio dall’uso dei contraccettivi orali se si considera l’alta prevalenza della APCr nella popolazione generale. Solo nel Nord America ci sono circa 100 milioni di utilizzatrici di contraccettivi orali. Considerando che l’allele della frequenza per il F.V R506 Q è presente nel 2.5%, allora circa 500.000 donne sarebbero eterozigoti e circa 6.000 sarebbero omozigoti.

Poiché il rischio annuale di TPV è all’incirca lo 0.3% nelle eterozigoti e circa il 3% per gli omozigoti, può essere calcolato che circa 1.700 casi di TVP all’anno sono causati dalla combinazione di APCr e contraccettivi orali.

Insomma, sembrerebbe che un numero significativo di donne dovrebbe evitare i contraccettivi orali essendo APCr.

Questo solleva la domanda se tutte le donne debbano essere sottoposte a screening per APCr prima della prescrizione dei contraccettivi orali.

 

APC RESISTENZA durante GRAVIDANZA e PARTO

I livelli di diverse plasma-proteine cambiano drammaticamente durante la gravidanza normale. Il risultato è un movimento nell’equilibrio emostatico a favore della coagulazione e contro l’anticoagulazione e la fibrinolisi.

Questo stato pretrombotico associato alla gravidanza probabilmente riduce il rischio di eccessivo sanguinamento durante il parto, sebbene nello stesso tempo aumenti il rischio di trombosi. Nei paesi sviluppati l’incidenza globale di eventi trombotici durante la gravidanza ed il puerperio è di circa lo 0.1%. La resistenza all’APC appare essere un forte fattore di rischio di trombosi durante la gravidanza ed il puerperio come è stato dimostrato da osservazioni dell’APCr in circa il 50-60% delle donne con una storia di complicanze trombotiche durante la gravidanza ed il puerperio..

Data questa alta prevalenza sembra necessario lo screening per l’APCr in tutte le donne durante la fase iniziale della gravidanza.

Le donne identificate come APC resistenti dovrebbero essere considerate come candidate ad una profilassi con eparina (15.000-20.000 U/die).

 

RESISTENZA all‘APC ACQUISITA

 Anticorpi Antifosfolipidi

Non è attualmente noto il meccanismo che provoca la sindrome da anticorpi antifosfolipidi, sebbene siano state suggerite, come possibile meccanismo di trombosi, delle interferenze nel meccanismo della proteina C.

Una di queste interferenze potrebbe essere il bloccaggio selettivo della funzione dell’APC sulle superfici fosfolipidiche mediante specifici tipi di anticorpi antifosfolipidi che porterebbero ad una APCr acquisita.

Deve essere notato però che la presenza della mutazione del F.V R506Q non sembra essere rappresentata in maniera anomala in pazienti con la sindrome antifosfolipidica.

Cambi ormonali possono ridurre l’APC ratio

Un APC ratio più basso è stato trovato nelle donne che assumevano contraccettivi orali quando confrontate o con donne che non usavano contraccettivi orali o con uomini.

APC ratio più bassi sono stati anche riportati in donne sane in gravidanza, quando le si confronta a donne sane non in gravidanza né in trattamento con contraccettivi orali.

Il meccanismo di questa APCr acquisita è probabilmente indotta dagli ormoni e la loro rilevanza clinica attende ulteriori studi.

 

TABELLA: Indicazioni sui candidati alle indagini per trombofilia

 

  • Trombosi venose giovanili (età inferiore a 45 anni)
  • Trombosi venosa ricorrente
  • Storia familiare di trombosi venosa
  • Trombosi venosa in siti inusuali
  • Trombosi neonatale
  • Necrosi cutanea (specie se indotta dalla warfarina)
  • Aborti ricorrenti
  • Trombosi arteriosa giovanile sotto i 30 anni
  • Trombosi arteriosa senza danni arteriosi
  • Trombosi venosa durante la gravidanza o il puerperio
  • Trombosi venosa durante la assunzione di contraccettivi orali

Campione: plasma (provetta anticoagulata con citrato).

E’ sempre necessario ripetere l’esame su un campione diverso prelevato a distanza di tempo dal primo.

Esami collegati: PT, aPTT, fibrinogeno, AT III, PC, PS, LAC, Omocisteina.

 

< Torna all’elenco analisi