Metodo: (Western-Blot) Campione: Plasma edta
Tempo di refertazione: 12gg Valore di riferimento:

p17                assente

p24                assente

p31                assente

GP41 (ENV)  assente

GP120 (ENV) assente

SGP105(ENV) assente

GP36               assente

 

 

 

 

Note:

L’HIV è un retro virus (virus ARNA) del genere dei lentivirus. I lentivirus provocano malattie caratterizzate da un lungo periodo di incubazione e da un decorso prolungato. L’AIDS rappresenta solo lo stadio terminale di un processo patogenetico continuo e progressivo. Questo processo comincia con una primaria infezione da HIV, continua con una fase cronica di solito asintomatica, porta a sintomi progressivamente più severi e conduce, alla fine, a profonda immunodeficienza. Quest’ultima rende le sue vittime suscettibili a varie infezioni opportunistiche e a rare forme di tumori maligni, che sono la causa della morte diretta dell’individuo.

 

L’infezione delle cellule bersaglio

Nei soggetti infetti il livello di HIV nel sangue e nello sperma è alto, nel siero e nelle secrezioni vaginali è piuttosto basso e in altri liquidi corporei, come urina, saliva e lacrime, è ancora più basso. Le principali vie di trasmissione sono pertanto i rapporti sessuali, le trasfusione di sangue o di emoderivati, l’uso in comune di siringhe e la trasmissione per via transplacentare da madre infetta a figlio. Tutte queste vie di trasmissione probabilmente coinvolgono il virus associato a cellule (macrofagi, cellule dendritiche e linfociti). Quando il virus entra in circolo, esso infetta le cellule bersaglio. Il recettore cellulare principale dell’HIV è il CD4. Esso si trova su: linfociti TH, macrofagi, monoliti, cellule dendritiche dei linfonodi, cellule di Langerhans, cellule staminali emopoietiche, alcune cellule della micosa rettale e cellule della microglia. Poiché i massimi livelli di CD4 sono espressi dai linfociti TH, l’HIV è l’infocitotropo. L’HIV, dopo essersi legato al suo recettore, fonde il suo involucro con la membrana della cellula bersaglio. Il nucleocapside è inglobato nella cellula, l’RNA virale si libera e viene trascritto in DNA dalla trascrittasi inversa del virus. Il DNA virale poi si integra nel menoma della cellula ospite dando luogo a un provirus. Il provirus può rimanere allo stato latente per un periodo di tempo indeterminato. Il DNA virale rimane permanentemente associato al DNA della cellula ed è trasmesso alle cellule figlie a ogni divisione cellulare. Nello stato di latenza i geni virali non sono espressi e il virus rimane nascosto al sistema immunitario. Il provirus rimane allo stato latente fino allo stato in cui si verificano determinati eventi che innescano l’attivazione del provirus. Con l’attivazione i geni strutturali del virus vengono trascritti in mRNA ed esso viene tradotto nelle proteine virali. Queste cominciano ad assemblarsi e contemporaneamente la membrane della cellula ospite viene modificata dall’inserimento della gp 41 e della gp 120. Poi l’RNA virale e le proteine del capside si assemblano a ridosso della membrana cellulare modificata. Essa costituirà l’involucro attraverso un processo di gemmazione. La serie di eventi descritta viene chiamata ciclo litico.

L’attivazione del provirus e la gemmazione delle particelle virali neoformate in alcuni casi porta alla lisi della cellula infettata, in altri casi permette la sopravvivenza della cellula infettata. Il destino della cellula infettata è influenzato dal livello di CD4 che essa esprime. Cellule che esprimono un alto livello di CD4 (come i linfociti TH) liberano molti virioni e vanno incontro a lisi, cellule che esprimono un basso livello di CD4 (come macrofagi, monociti e cellule dendritiche dei linfonodi) liberano pochi virioni e sopravvivono. Quindi macrofagi e cellule dendritiche possono accogliere il virus, proteggerlo dalla risposta immunitaria e funzionare da compartimento di riserva. Da questo compartimento il virus può diffondere in tutto l’organismo oppure può essere trasmesso ad altri soggetti.

 

Dall’infezione alla malattia

A grandi linee l’andamento della malattia può essere diviso in tre fasi:

  • l’infezione primaria decorre asintomatica in più del 50% dei soggetti.
  • il periodo di latenza è quello che intercorre tra la sieroconversione e la comparsa dell’AIDS conclamata. LA sua durata media è stimata attorno agli 11 anni. Esso è caratterizzato dalla diminuzione più o meno lenta o più o meno progressiva del numero dei linfociti T CD4+ Spesso è presente una linfoadenomegalia generalizzata (Linfoadenopatia Persistente Generalizzata, PGL). Durante questa fase possono comparire una serie di quadri clinici correlati all’infezione dell’HIV. La presenza di questi quadri non è indicativa della sindrome conclamata.
  • il periodo dell’AIDS conclamato è caratterizzato dalla comparsa di infezioni da opportunisti o di condizioni patologiche correlate all’infezione da HIV un presenza delle quali si può dare la diagnosi di AIDS.

Attualmente i CDC definiscono l’AIDS conclamato in un adulto, o in un adolescente di 13 anni o più, come la presenza di una delle 25 condizioni indicative di severa immunosoppressione (come la polmonite da Pneumocystis carinii) associata all’infezione da HIV o la presenza dell’infezione da HIV in un soggetto con numero di linfociti T CD4+ inferiore alle 200 cellule /ml di sangue ( vedi riquadro).

 

La distruzione dei linfociti  T CD4+

Come detto sopra, una delle prime osservazioni sulle compromissioni del sistema immunitario presenti nell’infezione da HIV è stata la presenza di ridotti livelli di linfociti T CD4+ circolanti. I soggetti non infetti presentano nel sangue periferico un numero di linfociti T CD4+ pari a circa 1100 cellule/ml. Nei soggetti con AIDS questo numero diminuisce drammaticamente, scendendo sotto le 200 cellule/ml  nello stadio avanzato della malattia. In questo stadio il soggetto diventa estremamente suscettibile alle infezioni opportunistiche e alle neoplasie. Circa il 40% dei pazienti con AIDS e infezioni opportunistiche non presenta nessuna cellula CD4+ evidenziabile nel sangue periferico. Questo gruppo di pazienti ha la più breve aspettativa di vita tra i pazienti con AIDS. Il rapporto numerico tra linfociti T CD4+ e linfociti T CD8+ nel sangue periferico nei soggetti no infetti è di circa 2, mentre nei soggetti con AIDS è inferiore a 1 e, a volte, è inferiore a 0.2. La deplezione dei linfociti T CD4+ riguarda sia quella infettate dal virus che quelli non infettati. La deplezione dei linfociti T CD4+ infettati dall’HIV avviene attraverso tre meccanismi: lisi diretta indotta dal virus, risposta immunitaria umorale e risposta immunitaria cellulo-mediata che uccidono le cellule infettate. Per spiegare la deplezione dei linfociti T CD4+ non infettati dall’HIV sono stati proposti vari meccanismi possibili: formazione di sincizi (cellule giganti multinucleate derivanti dalla fusione di linfociti T CD4+) che producono molti virioni e poi muoiono, distruzione dei linfociti T CD4+ mediata dalla gp120 solubile, interferenza della gp120 solubile con la maturazione timica dei linfociti T CD4+, morte cellulare programmata inopportuna dei linfociti T CD4+ mediata dalla gp120 solubile. Il collasso del sistema immunitario che si verifica nell’infezione da HIV mette in risalto il ruolo centrale svolto dai linfociti T CD4+ nelle risposte immunitarie sia umorale che cellulo-mediata.

 

Le altre alterazioni immunologiche  provocate dall’infezione da HIV

L’ingresso dell’HIV in circolo produce un’iniziale viremia. In questa fase i virioni sono riscontrabili nel plasma e nei linfociti circolanti. Poco dopo l’infezione il soggetto produce anticorpi efficaci contro il virus. Questi anticorpi circolanti formano complessi con i virioni e il virus scompare dal sangue periferico. Nella maggior parte dei casi l’HIV ricompare in circolo dopo una decina di anni. Durante la risposta anticorpale alcuni virioni sono eliminati altri infettani i tessuti linfoidi periferici (linfonodi, milza, tonsille, adenoidi). Questi tessuti contengono le cellule follicolari dendritiche  che possono essere infettate e funzionare da compartimento di riserva per una continua infezione dei linfociti T CD4+.

Biopsie dei tessuti linfatici periferici di soggetti infettati hanno rivelato che il virus si replica attivamente in questi tessuti e raggiunge i livelli 10-100 volte superiori rispetto a quelli riscontrabili nei linfociti T CD4+ circolanti. I linfonodi infettati vanno incontro a progressive e profonde alterazioni strutturali con l’avanzare della malattia. Nei soggetti con l’AIDS allo stadio intermedio (con un numero di linfociti T CD4+ pari a 200-499 cellule/l) i linfonodi cominciano a presentare segni di disgregazione strutturale. Nei soggetti con AIDS allo stadio avanzato (con un numero di linfociti T CD4+ inferiore alle 200 cellule/l) i linfonodi presentano danni estesi e necrosi tessutale. Le cellule follicolari dendritiche muoiono e, conseguentemente, i centri germinativi scompaiono. La distruzione della struttura dei linfonodi riduce la loro capacità di intrappolare le particelle virali e di fornire l’ambiente adatto all’attivazione dei linfociti B e T. Aumenta così la quantità di virus in circolo e peggiorano le manifestazioni cliniche dell’AIDS. Altre alterazioni del sistema immunitario conseguenti all’infezione da HIV sono: ridotta risposta all’antigene da parte dei linfociti TH, inefficacia della risposta anticorpale, produzione sbilanciata di citochine, riduzione della risposta DTH, riduzione dell’attività dei linfociti T citotossici attivi (CTL) e delle cellule  Natural Killer (NK), alterata regolazione della risposta immunitaria.

 

Il genoma e la variabilità genetica dell’HIV

Come per tutti i retrovirus, il genoma dell’HIV contiene tre geni principali: gag, pol ,ed env. Questi geni dirigono la formazione dei componenti di base dell’HIV.

Il gene gag codifica per una poliproteina che è scissa da una proteasi virale codificata da pol, in quattro proteine: p24, p7, p9 e p17.

Il gene pol codifica per una poliproteina  che è scissa da una proteasi virale, codificata da pol, in tre enzimi: trascrittasi inversa, proteasi ed integrasi.

Il gene env codifica per una poli proteina (gp160) che è scissa da una proteasi della cellula ospite nelle glicoproteine dell’involucro gp120 e gp41.

 

L’HIV ha la capacità di mutare geneticamente con facilità: la frequenza di mutazione dell’HIV è 65 volte quella del virus dell’influenza, il quaìle ha a sua volta una elevata frequenza di mutazione. L’elevata frequenza di mutazione dell’HIV è dovuta alla trascrittasi inversa del virus che introduce approssimativamente una mutazione ogni 2000 nucleotidi incorporati. Questa elevata frequenza di mutazione produce varianti dell’HIV nel medesimo soggetto infetto. Esse possono resistere alla risposta immunitaria, essere più citotossiche, generare sincizi più rapidamente o resistere alla terapia farmacologica.

Studi filogenetici hanno identificato gruppi di geni env dell’HIV-1, che si sono originati con la progressione epidermica dell’AIDS in tutto il mondo. Questi gruppi di geni env, influenzano il fenotipo dll’HIV-1, producendo così diversi sottotipi.

 

Il profilo sierologico dall’infezione da HIV

In seguito all’infezione da HIV si verifica una serie di fenomeni sierologici utilizzati per la diagnosi dell’infezione. Inoltre l’osservazione dello sviluppo dei dati sierologici può servire predire la progressione dalla fase di latenza alla fase litica, che culmina con la diagnosi di AIDS conclamato. Poco dopo l’infezione il virus si replica molto attivamente e la proteina p24 del core virale può essere rivelata nel siero mediante tecniche ELISA o RIA. L’antigene p24 rimane nel siero solo per poche settimane e scompare nel momento in cui compare la risposta anticorpale (sieroconversione). In genere tra l’infezione e la sieroconversione passano circa sei settimane, ma in alcuni soggetti passano più di 3 anni.

Nel momento della siero conversione possono essere trovati anticorpi anti-HIV di tipo IgM nel volgere di poche settimane essi si riducono e appaiono anticorpi anti-HIV di tipo IgG. Questi ultimi sono specifici per varie proteine strutturali del virus (gp120, gp41, p24 e p17). La comparsa e la persistenza degli anticorpi anti-HIV core (anti-p24) è correlato con la fase di latenza del virus: fino a quando i livelli di anticorpi anti-HIV core sono elevati il soggetto rimane asintomatico. Quando i livelli di anticorpi anti-HIV core calano, aumentano i livelli di antigene p24. Questi cambiamenti sono associati con la progressione dell’HIV dallo  stato di latenza al ciclo litico e sono utilizzati, nella pratica clinica, per diagnosticare la progressione verso la malattia conclamata.

 

Il profilo sierologico dell’infezione da HIV

In seguito all’ infezione da HIV si verifica una serie di fenomeni sierologici utilizzati per la diagnosi dell’infezione. Inoltre l’osservazione dello sviluppo dei dati sierologici può servire a predire la progressione dalla fase di latenza alla fase litica, che culmina con la diagnosi di AIDS conclamato. Poco dopo l’infezione il virus si replica molto attivamente e la proteina p24 del core virale può essere rivelata nel siero mediante tecniche ELISA o RIA. L’antigene p24 rimane nel siero solo per poche settimane e scompare nel momento in cui compare la risposta anticorpale (sieroconversione). In genere tra l’infezione e la sieroconversione passano circa sei settimane, ma in alcuni soggetti passano più di tre anni. Nel momento della sieroconversione nel siero possono essere trovati anti-HIV di tipo IgM. Nel volgere di poche settimane essi si riducono e appaiono anticorpi anti-HIV di tipo IgG. Questi ultimi sono specifici per varie proteine strutturali del virus (gp120, gp41, p24 e p17). La comparsa e la persistenza degli anticorpi anti-HIV core (anti-p24) è correlata con la fase di latenza del virus: fino a quando i livelli di anticorpi anti-HIV core sono elevati, il soggetto rimane asintomatico.

Quando i livelli di anticorpi anti-HIV core calano, aumentano i livelli di antigene p24. Questi cambiamenti sono associati con la progressione dell’HIV dallo stato di latenza al ciclo litico e sono utilizzati, nella pratica clinica, per diagnosticare la progressione verso la malattia conclamata.

 

Il protocollo diagnostico

Lo schema del protocollo diagnostico si deve adattare alla storia clinica del soggetto,ovvero deve tener conto dei fattori di rischio o delle patologie in corso. Risposte negative dei test di screening in presenza di patologie indicatrici di AIDS (es. linfoadenopatia generalizzata persistente [PGL] o risposte indeterminate in presenza di fattori di rischio (es.tossicodipendenza) richiedono test di conferma e di apprendimento.

 

Lo schema generale del protocollo diagnostico

Il test per lo screening di base dell’infezioneda HIV è la ricerca nel siero degli anticorpi anti-HIV mediante test ELISA indiretto o test EIA dags. In questi due saggi immunoenzimatici gli antigeni virali (lisato virale,peptici ricombinanti gag ed env e/o peptici sintetici codificati dal gene env) sono adesi su fase solida (pozzetti di una piastra di microtitolazione  o biglie di plastica). Il siero di individui infettati da HIV dopo la sieroconversione contiene anticorpi diretti contro le proteine virali.

Nel test ELISA indiretto:

  • il siero da analizzare viene seminato sulla piastra da elisa e lasciato reagire
  • gli anticorpi che non si legano agli antigeni virali sono poi lavati via
  • vengono aggiunti anticorpi di capra anti-immunoglobuline umane coniugati con un enzima, l’eccesso di anticorpo è lavato via
  • è aggiunto un substrato dell’enzima
  • il prodotto di reazione colorato che si forma è misurato mediante lettori spettrofotometrici.

Nel EIA DAGS (saggio immunoenzimatico a due passi basato sul principio del sandwich a doppio antigene per la determinazione simultanea di tutte le classi di immunoglobuline):

  • il siero da analizzare viene incubato con una biglia rivestita di antigeni ricombinati;
  • se il siero del soggetto contiene anticorpi anti-HIV, essi reagiscono con gli antigeni fissati alla biglia;
  • dopo l’incubazione il materiale non legato è aspirato e la biglia è lavata;
  • le immunoglobuline umane che rimangono legate alla fase solida vengono rilevate incubando il complesso biglia-antigene-anticorpo con una soluzione contenente proteine ricombinanti e peptici sintetici coniugati con l’enzima perossidasi;
  • il coniugato enzimatico non legato viene aspirato e le biglie vengono lavate;
  • al complesso biglia-antigene-anticorpo-antigene coniugato con l’enzima viene aggiunto un substrato dell’enzima;
  • il prodotto di reazione colorato che si forma è misurato mediante lettori spettrofotometrici.

La positività della reazione nel test ELISA indiretto o nel test EIA dags indica la presenza di anticorpi anti-HIV nel siero del soggetto e quindi la sua esposizione al virus.

Tra l’infezione virale e la comparsa di un a quantità sufficiente di anticorpi evidenziabili mediante il test ELISA o il test EIA dags intercorre un periodo definito “fase finestra”. In genere esso è di sei settimane dall’infezione,ma, raramente. Può essere più lungo. Nelle fasi finali della malattia i soggetti con AIDS possono risultare negativi alla ricerca di anticorpi anti-HIV. Infatti la deplezione dei linfociti TH causa l’abbassamento del livello degli anticorpi nel siero. Quindi, nella fase finestra e nella fase finale della malattia,i soggetti con infezione da HIV possono risultare negativi alla ricerca nel siero degli anticorpi anti-HIV mediante test ELISA indiretto o test EIA dags. I sistemi immunoenzimatici (ELISA e EIA dags) attualmente in uso sono quelli di seconda e terza generazione. Essi utilizzano come antigeni virali peptici sintetici da soli o in combinazione con lisato virale e proteine ricombinanti. La ricerca nel siero degli anticorpi anti-HIV viene effettuata sia per l’HIV-1 che per l’HIV-2. Di norma si effettuano due test ELISA o due test EIA dags di screening che utilizzano componenti antigeniche differenti dal virus. Il test di screening può dare tre diverse risposte: risposta positiva, risposta negativa oppure risposte indeterminata. In presenza di un test di screening negativo o indeterminato e di un quadro clinico che suggerisca un’infezione da HIV, si usano come test diagnostici il test ELISA per la determinazione dell’antigene p24,il Western blot e la PCR. Il test di conferma più usato è il Western blot.

Nel Western blot le proteine e le glicoproteine virali sono separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Sono commercialmente disponibili Kit che forniscono queste membrane con adesi gli antigeni virali.

La membrana di nitrocellulosa viene trattata prima con il siero da analizzare e poi con anticorpi di capra anti-immunoglobuline umane coniugate con un tracciante enzimatico. L’eventuale reazione antigene-anticorpo viene evidenziata mediante l’aggiunta di un substrato cromogeno precipitante. La presenza di bande colorate in corrispondenza delle varie proteine e glicoproteine virali indica la presenza di anticorpi anti-HIV nel siero del soggetto.

Il Western blot viene effettuato sia per l’HIV-1 che per l’HIV-2. Anche questo test può dare tre diverse risposte: risposta positiva, risposta negativa o risposta indeterminata. Attualmente non esiste un criterio universale per interpretare i risultati del test Western blot. Esistono criteri diversi adottati da enti internazionali.

 

Criteri per l’interpretazione del Western blot

 

ASTPHLD: (Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors)/CDC (Centers for Disease Control)

 

p24 e gp41 o gp120 e gp160

FDA (Food and Drug Administration)

p24 e p31 e gp41 o gp120/160

American Red Cross

almeno tre bande: una per gruppo di prodotti genici (gag, pol e env)

 

CRSS Consortium for Retrovirus Serology Standardization)

almeno due bande: p24 o p31 e gp41 o gp120/160

 

WHO (World Health Organization)

almeno due bande env

 

In caso di indeterminatezza del Western blot si usa la PCR. La Polymerase Chain Reaction è una tecnica sofisticata, rapida e potente che utilizza DNA ricombinante. Essa può essere utilizzata per amplificare un piccolo numero di copie di DNA provirale da una grossa quantità di DNA cellulare. L’identificazione del DNA provirale dell’HIV mediante PCR avviene in tre fasi: separazione e lisi delle cellule mononucleate a partire da sangue intero, amplificazione del DNA provirale e rivelazione dell’amplificato. La PCR richiede che le sequenze del DNA che si trovano all’estremità del DNA provirale siano note, affinché possano essere sintetizzati brevi oligonucleotiti che fungono da primer (innesco). La miscela di DNA cellulare viene estratta e denaturata a singoli filamenti mediante un breve trattamento a caldo. Poi il DNA è raffreddato in presenza di un eccesso di primer oligonucleotidici. Essi ibridizzano con ssDNA complementare. E’ quindi aggiunta una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi) insieme ai quattro desossiribonucleotidi trifosfato. Ciascun filamento è copiato. I due filamenti di DNA appena sintetizzato vengono denaturati a singoli filamenti mediante un brevetrattamento a caldo e il ciclo è ripetuto. In ciascun ciclo la presenza di DNA provirale è duplicata. Quindi, dopo alcuni cicli, la sequenza sarà amplificata moltissime volte (in teoria esponenzialmente), fino a diventare preponderante rispetto a tutte le altre. La resa di ogni singolo passaggio non è del 100 %, ma è fra il 60 e 80 %. In 20-30 cicli la sequenza di DNA provirale può essere amplificata fino a un milione di volte. Sono stati sviluppati vari metodi di rilevazione del prodotto amplificato. Essi utilizzano l’ibridazione dell’amplificato con una sonda specifica adesa su micropiastra e l’evidanziazione dell’ibrido con una reazione enzimatica colorimetrica, il dott-blot oppure l’elettroforesi capillare. Questa tecnica ha evidenziato una infezione da HIV in soggetti che erano risultati negativi all’ELISA indiretto e al Western blot. In caso di indeterminatezza del test di screening, l0infezione può essere diagnosticata, oltre che con il Western blot, rivelando l’antigene p24 attraverso tecniche ELISA.

I test ELISA per la determinazione dell’antigene p24, attualmente disponibili in commercio ,si basano sul principio del sandwich. Essi consentono sia un risultato qualitativo (risposta positiva o negativa) che un dosaggio quantitativo dell’antigene. I test ELISA per la determinazione dell’antigene p24 utilizzano anticorpi monoclinali murini adesi su fase solida. A quest anticorpi il siero da analizzare viene aggiunto e lasciato reagire. Se iol siero del soggetto contiene gli antigeni p24, essi reagiscono con gli anticorpi immobilizzati. Dopo l’incubazione il materiale non è legato  è lavato via. Viene poi aggiunto un secondo anticorpo coniugato con un enzima e specifico per un altro epitomo dell’antigene. Il coniugato enzimatico non legato è lavato via ed è aggiunto il substrato dell’enzima. Il prodotto di reazione colorato che si forma è misurato mediante lettori spettofotometrici. I test che utilizzano gli antigeni virali per la diagnosi dell’ HIV cambiano periodicamente, in relazione all’enorme variabilità genetica  del virus. I nuovi test devono contenere le componenti antigeniche dei nuovi ceppi del virus (per es. il sottotipo 0 dell’HIV-1). I criteri per orientarsi nella scelta fra le varie ditte che producono i test dell’HIV sono dapprima la sensibilità e la specificità del test, poi la rapidità, la possibilità di automazione e il costo del test.

 

< Torna all’elenco analisi