Metodo: real time-PCR Campione: Sangue EDTA siero

 

 

Note:

Attualmente la diagnosi sierologia dell’infezione da HCV si basa principalmente sulla presenza o meno del siero del paziente di anticorpi specifici diretti contro antigeni strutturali (che fanno cioè parte del virus; gli antigeni non strutturali non fanno parte della struttura del virus ma entrano in gioco durante la fase di replicazione virale).

La presenza degli anticorpi comunque non indica immunizzazione ma al contrario spesso si associa alla persistenza del virus nell’organismo. I tests sierologici presentano peraltro problemi di non specificità e non sono indicatori attendibili della replicazione virale. Pertanto, la trascrizione inversa (RT) dell’HCV-RNA seguita dall’amplificazione mediante PCR del cDNA, è attualmente il miglior metodo per dimostrare la viremia da HCV.

La determinazione dell’HCV-RNA mediante PCR è una metodica altamente sensibile in grado di rilevare anche bassissime concentrazioni di acido nucleico del Virus C nel siero. Infatti, pur se in un numero limitato di casi, soggetti negativi alla ricerca degli anticorpi con il metodo RIBA mostrano positività per HCV-RNA. In tali sogetti la viremia si è rivelata transitoria o fluttuante, ciò nonostante il loro sangue deve essere considerato potenzialmente infettante. Nel sangue, l’RNA del virus può essere dimostrato mediante PCR già 1-2 settimane dopo l’infezione, circa un mese prima dell’aumento delle transaminasi (Piazza,1984) e mediante RT nested PCR anche dopo pochi giorni dall’infezione (Houghton,1996), in quanto questo metodo è in grado di rilevare fino ad un minimo di 20-25 copie virali per mL di plasma. Ed è proprio la diversa sensibilità delle suddette metodiche che spiega tale differenza di tempi nelle capacità di rilevazione. Un altro metodo per la rilevazione della viremia sviluppato recentemente è il cosiddetto bDNA (branched DNA), il quale per altro è meno sensibile delle tecniche che utilizzano la PCR: infatti questo metodo è in grado di rilevare 350.000 equivalenti genomici per mL mentre con le tecniche di PCR se ne possono rilevare 2.500.

 

TAB. Sensibilità dei metodi perla rilevazione del genoma HCV

Unità virali/mL di siero rilevabili

 

 metodo                  1-10                 10-100        100-1000         1000-10.000      10.000-100.000

PCR                         –                          –                -/+                         +++

Nested PCR             +/-                     +++

bDNA                      –                           –                  –                           –                      +++

 

Nel caso dell’epatite, l’inizio della malattia può essere ricondotto all’introduzione nell’organismo del virus C che è l’agente causale. Esiste quindi un primo intervallo nel quale è presente solo il virus, senza altre manifestazioni evidenti, pur esistendo la malattia. Il secondo intervallo è quello segnalato da manifestazioni subcliniche della malattia che non sono evidenti all’esame obiettivo, ma che possono essere messe in evidenza dall’aumento delle transaminasi o dalla presenza di anticorpi nel siero. Il terzo intervallo è quello manifesto della malattia nel quale il malato è itterico e presenta evidenti disfunzioni all’esame clinico.

E’ chiaro che fino a che non è stata possibile la rilevazione diretta della presenza del paziente del virus HCV, l’inizio della malattia non è stato rilevabile. Le tecniche oggi disponibili ci rendono in grado di identificare la presenza del virus HC  nei soggetti da esso infettati, anche molto tempo prima di qualunque altra manifestazione clinica. La viremia di HCV in soggetti affetti da epatite clinicamente evidente è definita dallo studio collaborativo Eurohep coordinato dalla Croce Rossa olandese in 360.000 molecole virali per mL di plasma. E’ quindi logico che individui  con viremia più bassa abbiano manifestazioni della malattia molto meno visibili, inclusa la possibilità di non generare anticorpi o di generare una quantità non rilevabile o comunque di impiegare un tempo superiore alla norma per generarli. E’altresì chiaro che una bassa viremia può condurre più facilmente alla completa eliminazione del virus dal plasma permettendone o soltanto l’eventuale localizzazione intracellulare nelle cellule bianche circolanti o addirittura l’eliminazione, situazione che è stata anche descritta clinicamente (Barrea, 1996; Schmidt, 1996; Mangia, 1996). Nel caso di sacche di plasma trovate positive alla nested PCR ma non alla PCR appartenenti a pazienti apparentemente in buona salute o comunque che non presentano anticorpi Anti-HCV a distanza di alcuni mesi, si può dunque ragionevolmente pensare che tali pazienti abbiano avuto una viremia così bassa da non mostrare sintomatologia ne altri marcatori attualmente considerati (transaminasi, anticorpi), ma evidenziabile solamente con PCR + nested PCR. Tali pazienti potrebbero non mostrare mai alcuna situazione di epatite in quanto completamente guariti, così come manifestarla a distanza di molto tempo. Per altro, il plasma di tali pazienti, contenendo una sia pur minima carica virale va considerato potenzialmente infettante.

 

Quando bisogna ricercare l’HCV-RNA?

Quando i test di screening ed i test supplementari orientano alla sua ricerca.

 

In quali casi si può eseguire l’HCV-RNA anche senza aver eseguito il profilo sierologico o con profilo sierologico negativo?

  • sospetta infezione acuta
  • neonati da madri HCV positive
  • soggetti che siano punti recentemente (negli ultimi quattro mesi) con aghi o con altri strumenti potenzialmente infetti;
  • sogetti monodepressi nei quali la risposta anticorpale non sia attendibile;
  • acquisizione passiva di anticorpi

 

Falsi negativi

Quanto fin qui esposto rende anche conto della non costante ripetibilità della ricerca del menoma virale in un soggetto che presenti una viremia così bassa. Infatti, data la presenza di pochissime copie virali e della minima quantità di campione che viene utilizzata per l’esame, è possibile che nel prendere l’aliquota di campione necessaria alla reazione di amplificazione non venga raccolta nemmeno una copia del menoma virale e quindi non venga eseguita l’amplificazione. Solo in questo caso limite (che però è numericamente possibile) possiamo parlare di falsi negativi non certo per i limiti dovuti per la tecnica in sé.

 

Falsi positivi

Sono possibili qualora venga amplificata una regione di acido nucleico non propria del virus ma appartenente ad un’altra sequenza genica. In questo caso però bisogna che gli iniziatori della reazione (primers) siano errati e corrispondano ad una diversa sequenza genica.

Non è infatti possibile per le leggi riconosciute della biologia molecolare che primers corretti amplificano una regione sbagliata. Comunque pur volendo ammettere un errore la seconda amplificazione a carico della medesima sequenza virale dovrebbe essere anch’essa sbagliata, altrimenti la sequenza virale amplificata potrebbe non essere rilevata poiché scarsa, ma non è certo possibile che una seconda sequenza specifica per il virus produca un altro errore.

Infine, anche volendo considerare tutte le eventuali più sfavorevoli dobbiamo ricordare che il sistema finale di rilevazione è costituito dalla reazione di ibridazione con la sonda specifica che può agganciarsi solo ed esclusivamente alla sequenza virale eventualmente presente, e non si tratta di una calamita che attira tutto ma di molecole che hanno una selettività enorme e reagiscono solo a determinate condizioni. Pertanto, in caso di errore è possibile il falso negativo ma non il falso positivo che si può verificare solo in caso di inquinamento manuale da parte dell’operatore nell’esecuzione delle reazioni.

 

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