Metodo: real time-PCR Campione: Sangue EDTA siero

 

 

Note:

Attualmente la diagnosi sierologia della��infezione da HCV si basa principalmente sulla presenza o meno del siero del paziente di anticorpi specifici diretti contro antigeni strutturali (che fanno cioA? parte del virus; gli antigeni non strutturali non fanno parte della struttura del virus ma entrano in gioco durante la fase di replicazione virale).

La presenza degli anticorpi comunque non indica immunizzazione ma al contrario spesso si associa alla persistenza del virus nella��organismo. I tests sierologici presentano peraltro problemi di non specificitA� e non sono indicatori attendibili della replicazione virale. Pertanto, la trascrizione inversa (RT) della��HCV-RNA seguita dalla��amplificazione mediante PCR del cDNA, A? attualmente il miglior metodo per dimostrare la viremia da HCV.

La determinazione della��HCV-RNA mediante PCR A? una metodica altamente sensibile in grado di rilevare anche bassissime concentrazioni di acido nucleico del Virus C nel siero. Infatti, pur se in un numero limitato di casi, soggetti negativi alla ricerca degli anticorpi con il metodo RIBA mostrano positivitA� per HCV-RNA. In tali sogetti la viremia si A? rivelata transitoria o fluttuante, ciA? nonostante il loro sangue deve essere considerato potenzialmente infettante. Nel sangue, la��RNA del virus puA? essere dimostrato mediante PCR giA� 1-2 settimane dopo la��infezione, circa un mese prima della��aumento delle transaminasi (Piazza,1984) e mediante RT nested PCR anche dopo pochi giorni dalla��infezione (Houghton,1996), in quanto questo metodo A? in grado di rilevare fino ad un minimo di 20-25 copie virali per mL di plasma. Ed A? proprio la diversa sensibilitA� delle suddette metodiche che spiega tale differenza di tempi nelle capacitA� di rilevazione. Un altro metodo per la rilevazione della viremia sviluppato recentemente A? il cosiddetto bDNA (branched DNA), il quale per altro A? meno sensibile delle tecniche che utilizzano la PCR: infatti questo metodo A? in grado di rilevare 350.000 equivalenti genomici per mL mentre con le tecniche di PCR se ne possono rilevare 2.500.

 

TAB. SensibilitA� dei metodi perla rilevazione del genoma HCV

UnitA� virali/mL di siero rilevabili

A�

A�metodoA�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� 1-10A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� 10-100A�A�A�A�A�A�A� 100-1000A� A�A�A�A�A�A�A�1000-10.000A�A�A�A�A� 10.000-100.000

PCRA�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -/+A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� +++

Nested PCRA�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� +/-A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� +++

bDNAA�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -A�A�A�A�A� A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�-A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� -A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A�A� +++

 

Nel caso della��epatite, la��inizio della malattia puA? essere ricondotto alla��introduzione nella��organismo del virus C che A? la��agente causale. Esiste quindi un primo intervallo nel quale A? presente solo il virus, senza altre manifestazioni evidenti, pur esistendo la malattia. Il secondo intervallo A? quello segnalato da manifestazioni subcliniche della malattia che non sono evidenti alla��esame obiettivo, ma che possono essere messe in evidenza dalla��aumento delle transaminasi o dalla presenza di anticorpi nel siero. Il terzo intervallo A? quello manifesto della malattia nel quale il malato A? itterico e presenta evidenti disfunzioni alla��esame clinico.

Ea�� chiaro che fino a che non A? stata possibile la rilevazione diretta della presenza del paziente del virus HCV, la��inizio della malattia non A? stato rilevabile. Le tecniche oggi disponibili ci rendono in grado di identificare la presenza del virus HCA� nei soggetti da esso infettati, anche molto tempo prima di qualunque altra manifestazione clinica. La viremia di HCV in soggetti affetti da epatite clinicamente evidente A? definita dallo studio collaborativo Eurohep coordinato dalla Croce Rossa olandese in 360.000 molecole virali per mL di plasma. Ea�� quindi logico che individuiA� con viremia piA? bassa abbiano manifestazioni della malattia molto meno visibili, inclusa la possibilitA� di non generare anticorpi o di generare una quantitA� non rilevabile o comunque di impiegare un tempo superiore alla norma per generarli. Ea��altresA� chiaro che una bassa viremia puA? condurre piA? facilmente alla completa eliminazione del virus dal plasma permettendone o soltanto la��eventuale localizzazione intracellulare nelle cellule bianche circolanti o addirittura la��eliminazione, situazione che A? stata anche descritta clinicamente (Barrea, 1996; Schmidt, 1996; Mangia, 1996). Nel caso di sacche di plasma trovate positive alla nested PCR ma non alla PCR appartenenti a pazienti apparentemente in buona salute o comunque che non presentano anticorpi Anti-HCV a distanza di alcuni mesi, si puA? dunque ragionevolmente pensare che tali pazienti abbiano avuto una viremia cosA� bassa da non mostrare sintomatologia ne altri marcatori attualmente considerati (transaminasi, anticorpi), ma evidenziabile solamente con PCR + nested PCR. Tali pazienti potrebbero non mostrare mai alcuna situazione di epatite in quanto completamente guariti, cosA� come manifestarla a distanza di molto tempo. Per altro, il plasma di tali pazienti, contenendo una sia pur minima carica virale va considerato potenzialmente infettante.

 

Quando bisogna ricercare la��HCV-RNA?

Quando i test di screening ed i test supplementari orientano alla sua ricerca.

 

In quali casi si puA? eseguire la��HCV-RNA anche senza aver eseguito il profilo sierologico o con profilo sierologico negativo?

  • sospetta infezione acuta
  • neonati da madri HCV positive
  • soggetti che siano punti recentemente (negli ultimi quattro mesi) con aghi o con altri strumenti potenzialmente infetti;
  • sogetti monodepressi nei quali la risposta anticorpale non sia attendibile;
  • acquisizione passiva di anticorpi

A�

Falsi negativi

Quanto fin qui esposto rende anche conto della non costante ripetibilitA� della ricerca del menoma virale in un soggetto che presenti una viremia cosA� bassa. Infatti, data la presenza di pochissime copie virali e della minima quantitA� di campione che viene utilizzata per la��esame, A? possibile che nel prendere la��aliquota di campione necessaria alla reazione di amplificazione non venga raccolta nemmeno una copia del menoma virale e quindi non venga eseguita la��amplificazione. Solo in questo caso limite (che perA? A? numericamente possibile) possiamo parlare di falsi negativi non certo per i limiti dovuti per la tecnica in sA�.

 

Falsi positivi

Sono possibili qualora venga amplificata una regione di acido nucleico non propria del virus ma appartenente ad una��altra sequenza genica. In questo caso perA? bisogna che gli iniziatori della reazione (primers) siano errati e corrispondano ad una diversa sequenza genica.

Non A? infatti possibile per le leggi riconosciute della biologia molecolare che primers corretti amplificano una regione sbagliata. Comunque pur volendo ammettere un errore la seconda amplificazione a carico della medesima sequenza virale dovrebbe essere ancha��essa sbagliata, altrimenti la sequenza virale amplificata potrebbe non essere rilevata poichA� scarsa, ma non A? certo possibile che una seconda sequenza specifica per il virus produca un altro errore.

Infine, anche volendo considerare tutte le eventuali piA? sfavorevoli dobbiamo ricordare che il sistema finale di rilevazione A? costituito dalla reazione di ibridazione con la sonda specifica che puA? agganciarsi solo ed esclusivamente alla sequenza virale eventualmente presente, e non si tratta di una calamita che attira tutto ma di molecole che hanno una selettivitA� enorme e reagiscono solo a determinate condizioni. Pertanto, in caso di errore A? possibile il falso negativo ma non il falso positivo che si puA? verificare solo in caso di inquinamento manuale da parte della��operatore nella��esecuzione delle reazioni.

 

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